SEMI SINTETICI
Uno dei motivi per cui è efficace produrre embrioni somatici è che il materiale è già pronto per lo sviluppo di una pianta. Questi embrioni possono essere conservati sotto forma di semi sintetici, vengono incapsulati in arginato di sodio, dopo diversi anni questa tecnica fu evoluta e utilizzata anche su gemme radicali e altri elementi. L'embrione viene incapsulato poiché manca di un involucro di protezione, non tutti ne hanno però la necessità poiché alcuni hanno già un tipo di rivestimento. Vengono utilizzate piante che fanno parte delle Angio e Gimnosperme. Gli embrioni incapsulati sono anche chiamati semi nudi, una volta incapsulati vengono disidratati per mantenersi per molto tempo. Alcuni però non possono essere disidratati, in questo caso si utilizza un'altro tipo di tecnica dove vengono messi in azoto liquido e fatti congelare a -180°.
Semi disidratati:
Se il seme è di partenza già secco viene lasciato essiccare ulteriormente, una volta terminata la disidratazione si valuta il peso secco, se risulta costante significa che non vi è più acqua. Si prepara l'idrogel, gli embrioni secchi vengono fatti mescolare in questa soluzione, con una pinzetta si raccoglie la soluzione e la si fa gocciolare in una soluzione di cloruro di calcio permettendo uno scambio ionico.
Gli embrioni somatici in alcuni casi possono avere dei problemi di sviluppo come la non tolleranza dei tipi di stress, in questo caso si cambia tecnica.
EMBRIOGENESI DA POLLINE:
L'embriogenesi può partire anche da un granulo pollinico. Le antere sono il sito di produzione di questi granuli, ognuno di essi è prodotto da microspore prodotte per meiosi, quindi si ha due cellule aploidi che possono essere colturale in vitro. Dopo la meiosi la microspora produce un corredo genetico unico diverso da tutti gli altri. In tale embriogenesi vengono prodotti embrioni androgenici ovvero si parte dal maschio con un embrione aploide, siamo quindi completamente fuori da ciò che accade in natura, si avrà quindi un riarranciamento molto importante. Il fenomeno di androgenesi si può verificare anche in natura quando si ha la degenerazione del nucleo ovarico, ovvero quando il nucleo femminile viene sostituito da quello maschile, è un fenomeno molto sporadico. A differenza dell'embriogenesi somatica questa può essere un po' più applicata. Questo tipo di embriogenesi studia come è possibile la produzione di gameti maschili in assenza di fecondazione. Per realizzare tale metodo bisogna verificare che le specie siano idonee per questo metodo, non può essere effettuata sulle gimnosperme, anche se sono in corso alcune prove. Con questa tecnologia abbiamo la produzione di aploidi a partire da specie diploidi, poichè contengono un solo set di cromosomi nella fase di sporofito non hanno gameti funzionali e pertanto sono sterili, sensibili allo stress e alle malattie. Quando si ha il prodotto aploide si può mandare incontro al raddoppio cromosomico mediante diverse tecniche tra cui il breeding, ovvero l'incrocio di vari tratti per ottenere le caratteristiche desiderate, si può introdurre una caratteristica per cui l'aploide non è specializzata come la resistenza alle malattie. Si ottengono quindi dei DOUBLE IBRID, sono omozigoti su tutti i loci e hanno caratteristiche diverse, possono essere una nuova varietà oppure possono essere degli ibridi.
PIANTE AUTOGAME: autoimpollinanti, attraverso la moltiplicazione di genotipi aploidi si possono ottenere linee pure.
PIANTE ALLOGAME: impollinazione incrociata, i genotipi aploidi rappresentano le piante da incrociare per la costituzione di varietà ibride.
La produzione di linee pure usando doppi aploidi ha diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali, per esempio la linea da ottenere si può avere già nella generazione successiva anziché aspettare 5 gen. riducendo drasticamente il tempo totale, questi organismi vengono usati anche per studi di mutagenesi indotta cioè il perché una mutazione è avvenuta. è facile fare ciò poiché si hanno tutti loci omozigoti, è più semplice anche raccogliere informazioni su caratteri recessivi, cosa che in condizione normale non si riuscirebbe a fare poiché viene mascherato da quello dominante. si sono studiate anche le piante di asparagi, in cui avviene il dimorfismo sessuale determinato dal gene M. Le piante femmine sono recessive (mm) mentre i maschi sono eterozigoti (mM), usando il supermaschio (MM) tutta la linea progenie sarà maschile. La rigenerazione di questi ibridi dipende da diversi fattori come il genotipo, le condizioni di crescita, le condizioni della microspora, il tipo di terreno e i classici parametri che sono la luce, la temperatura e il ph.
VIVO: le microspore vengono prodotte per meiosi da due cellule madri andando incontro alla divisione mitotica, è asimmetrica e porta alla produzione di un grano pollinico bicellulare formato da cellule vegetative e cellule germinative.
Germinativa: produce nuclei spermatici, ha poco amido e un nucleo meno condensato quindi il livello di trascrizione è molto basso.
Vegetativo: accumula amido e lipidi che sono necessari per la germinazione del tubetto pollinico, conserva il citoplasma e ha trascrizione attiva.
VITRO: parte da microspora uninucleata, si ha solo il corredo genetico maschile, l'embrione prodotto sarà aploide con caratteristiche solo paterne. Ci deve essere una modificazione metabolica orientata alla maturazione dell'embrione.
Ci sono diversi fattori induttivi con lo stress, uno dei più frequenti è il calore, si utilizza il marcatore HIT SCHOK PROTEIN, marcatore della transizione verso l'embriogenesi. Tali marcatori si ritrovano in natura quando la pianta è sottoposta a stress di calore anche se sono marcatori generici.
Tra i fattori induttivi oltre al calore possono essere presenti anche lo stress osmotico o dallo stress dato dalla presenza o assenza di ormoni. è stato visto che se le cellule sono meno a contatto è possibile indurle verso l'embriogenesi da polline. In alcune piante la mancanza di alcuni nutrienti ha funzioni da stress inducendo l'androgenesi. Altri stress abiotici possono essere: l'uso della colchicina, mancanza di azoto, auxina, bassa temperatura e radiazioni di gamma in presenza di calore. Le piante possono essere pretrattate per indure ad androgenesi tramite l'utilizzo di stress, le antere vengono poi prelevate e messe in una coltura liquida fino alla formazione dell0embrione che viene poi posizionato in un terreno solido. Questo processo può essere fatto anche sugli ovuli quindi nella parte femminile, ma è più difficile e rende meno rispetto a quella maschile. Le antere vengono selezionate in base alla loro morfologia quindi se sono intatte e ben sviluppate, si possono fare anche degli studi preliminari per vedere quando il polline arriva a maturazione e quando lo si può prendere, deve sempre avere una vacuolazione tardiva che è la fase migliore per entrare in Androgenesi. In tale fase l'antera aumenta di dimensioni formando un vacuolo con diminuzione del citoplasma e quindi dell'amido contenuto all'interno. Il processo ha tre fasi:
1: Acquisizione della capacità di embriogenesi mediante uno stress, si inibisce il normale sviluppo della microspora e la si reindirizza verso la formazione di un embrione
2: Divisione cellulare nella microspora, conduce ad una struttura detta: ad uno strato multicellulare
3: Dalla struttura multicellulare si passa all'embrione vero e proprio.
Se dalla divisione della microspora uninucleata si forma una cellula germinativa, essa viene eliminata per morte cellulare programmata e non entra nel processo androgenico. Per questo rimane solo la cellula vegetativa che migra verso il centro e il vacuolo si frammenta formando delle specie di rotture che producono una struttura particolare a forma di stella. Quando si vede tale struttura si sa che è stata acquisita la potenzialità ambriogenica. La riprogrammazione dell'espressione genica causata dall'induzione dell'androgenesi può essere mediata da diversi fattori:
•Segnali ormonali, come l'IBA che è un auxina
•Repressione di geni tardivi
•Alterazione di processi specifici come fosforilazione e glicosilazione di proteine implicate nella maturazione del gametofito maschile.
Dopo la formazione della struttura a stella la cellula vegetativa si moltiplica per divisioni simmetriche successive fino a originare una STRUTTURA MULTICELLULARE, dopo di questa si ha l'embrione e la plantula. Le piante che vengono generate per androgenesi sono sterili quindi possono usare delle parti vegetative della pianta per produrre un callo e poi indurre diplodizzazione, la colchicina viene utilizzata per il raddoppio essa va a bloccare la divisione cellulare e non dovendo dividersi si ha un aumento cromosomico. A questo punto possono essere fatte delle trasformazioni sul polline con la metodica biolistica ovvero il granulo viene bombardato con idroproiettili. Come tutte le embriogenesi anche le androgenesi possono essere dirette e indirette, in quella diretta dalla divisione delle cellule aploidi si ottengono strutture simili ad embrioni chiamate embriodi, in quella indiretta dalla divisione delle cellule aploidi si ottengono calli indifferenziati
