1. Inverted repeat PTGS (IR-PTGS): grazie a questo meccanismo si è scoperto che l'introduzione di un gene esogeno provoca un silenziamento sia dello stesso gene che di quello endogeno. Questa tipologia fu scoperta nella petunia poiché si voleva rendere più colorato il petalo. Consisteva nel trasformare le piante facendo sovraesprimere in esse il gene della calcone sintasi, il gene era sotto controllo di un promotore forte e si sperava di ottenere un viola più intenso. Contro ogni aspettativa, furono ottenute alcune piante con una colorazione pallida dei fiori, altre pigmentate a settori bianchi e viola ed altre ancora completamente bianche. La trasformazione aveva causato il silenziamento del gene introdotto, tale fenomeno venne denominato co-soppressione. Maggiore era l'espressione del transgene e minore era il livello della calcone sintasi, Si osservò che la mancata espressione era dipendente dalla degradazione dei trascritti. In breve tempo, osservazioni simili furono compiute anche in sistemi animali e fungini. Si ritiene che i loci transgenici possano frequentemente dare origine a dsRNA a seguito di integrazioni imperfette che comprendono delle sequenze transgeniche senso e antisenso giustapposte. Le sequenze senso e antisenso hanno preso il nome di "inverted repeat PTGS". Il dsRNA generato in questo modo funge poi da attivatore del processo che coinvolge DCL e AGO, molti aspetti di questo meccanismo rimangono oggi ancora ignoti, la metodica viene utilizzata come uno degli strumenti più potenti per inattivare l'espressione di geni specifici. Questo approccio è chiamato RNA interference (RNAi). Il trascritto con sequenze ripetute e invertite può ripiegarsi su se stesso e generare un dsRNA, questo può interagire con due diversi DCL:
-DCL4 porta alla formazione di siRNA di 21 nucleotidi che, tramite l'intervento di AGO1, innescano la degradazione dei trascritti.
-DCL3 induce la formazione di siRNA di 24 nucleotidi che interagiscono con la cromatina silenziandola.
Malgrado il fatto che il meccanismo non sia ancora completamente chiarito, si è già giunti allo sfruttamento di questi processi per studi scientifici, si opera il silenziamento di geni determinati per mezzo dell'espressione di costrutti che contengono sequenze ripetute e invertite corrispondenti ad una porzione del gene di interesse da silenziare.
2. Sense PTGS S-PTGS, Sense Post Transcriptional Gene Silencing: Prevede la presenza di un transgene in singola copia in grado di produrre un trascritto che va ad attivare il silenziamento genico post trascrizionale. In questa regolazione viene coinvolto un enzima che è una polimerasi dipendenti detta RDR, tra gli enzimi di questo tipo è stata isolata la RDR 6 in grado di riconoscere trascritti aberranti. In generale questa RDR non lavora da sola ma interagisce con altre proteine come DCL, l'unico problema di questo meccanismo è che non si sa ancora con quale DCL possa interagire nello specifico ma diversi studi suggeriscono che la più plausibile sia l'interazione di DCL con una proteina AGO 1. Con questo meccanismo di regolazione si riconoscono degli mRNA difettosi riuscendo a riconoscerli e fungendo da controllo qualità. Il frammento aberrante viene riconosciuto da RDR 6 l'interazione del filamento con RDR da origine a un double stand RNA, interviene il DCL che processa il dbsRNA formato, quando ciò avviene si attiva anche HEN 1 (metil transferasi) e tale interazione causa la metilazione e la formazione di un piccolo RNA di tipo siRNA costituito da 21 nucleotidi, una volto prodotto si ha l'interazione con la proteina AGO, si ha un taglio del trascritto bersaglio perché può funzionare da slicing ed i frammenti ottenuti vengono riconosciuti e si riporta alla formazione di dsRNA riprendendo il ciclo. Questo tipo di processo sembrerebbe che porti al passaggio di informazioni tra cellule su distanza molto ampia ma degli studi hanno dimostrato che l'informazione può essere trasmessa anche su breve distanza ovvero tra cellule adiacenti.
3. microRNA: sono RNA a singolo filamento ripiegati su se stessi, la loro lunghezza varia tra i 20 e 24 nucleotidi, agiscono su RNA target inducendone la degradazione o riducendone la traduzione. Si deduce che questa via di controllo sia antica e il meccanismo è conservato, hanno un importante ruolo nel controllo dello sviluppo, organismi incapaci di produrre miRNA presentano sempre gravi difetti fenotipici, dimostrando l'importanza regolativa di questi piccoli RNA. Sono coinvolti nello sviluppo degli organi floreali, nella produzione di asimmetria a livelli di foglia ecc. tali miRNA si trovano negli animali prevalentemente in introni mentre nelle piante in regioni tra un gene e l'altro dette intergeniche. Questi miRNA possono arrivare a mostrare un profilo di espressione molto diversa sia da un punto di vista spaziale che temporale. Il trascritto primario Pri-miRNA, forma una struttura con appaiamento imperfetto e viene processato da DCL1 per produrre le strutture a 20-24 nucleotidi (miRNA) stabilizzate dalla metilazione condotta da HEN1. Il trasporto verso il citoplasma dal nucleo è operato dalla proteina HASTY; l'interazione con AGO1 permette poi di agire tagliando i trascritti (slicing) e/o inibendo la traduzione. I miRNA sono a loro volta regolati a livello trascrizionale mostrando profili di espressione ben definiti a livello spaziale e temporale. DCL1 e AGO sono le proteine chiave della sintesi dei miRNA e tali proteine sono a loro volta regolate da miRNA per esempio miR162 e miR168 consentono una regolazione a feedback garantendo un equilibrio nella produzione di miRNA.
4. ta-siRNA (trans acting small interfering RNA): derivano da loci particolari detti TAS, sono dei precursori per la sintesi dei siRNA. Questo meccanismo prevede degli step:
- La formazione del trascritto
- Il taglio del trascritto in seguito all'intervento di miRNA specifici
- L'interazione dei frammenti tagliati con RDR6 per generare dei dsRNA lunghi (particolarità)
- Il processamento da parte di DCL4 a formare dei siRNA di 21 nucleotidi (i tasiRNA).
I ta-siRNA possono interagire con AGO1 ed il relativo RISC, questo permette di degradare i trascritti bersaglio. I frammenti del trascritto funzionano da stampo per la sintesi del filamento complementare da parte da RDR6 con la formazione di un lungo dsRNA. Il dsRNA formatosi viene processato da DCL4 a formare dei siRNA di 21 nucleotidi: i ta-siRNA. Essi sono caricati in un complesso RISC contenente AGO1, la cui attività fa sì che avvenga la degradazione dei siti bersaglio. I ta-siRNA in realtà sono diversi dai miRNA perché sono capaci di spostarsi in una pianta però la distanza non supera di 10- 15 cellule mentre i miRNA sia su lunghe distanze sia su corte, non sono limitate. Questa differenza di comportamento è coerente con il ruolo dei siRNA nelle risposte di difesa verso i virus e con quello dei miRNA nel guidare eventi di sviluppo morfogenetico. La capacità di trasferire il segnale da una cellula all'altra dipende probabilmente dal tipo di DCL che interagisce con l'RNA, si suppone questo perché DCL1 non porta ad un segnale mobile come quello dei ta infatti essa è coinvolta nel meccanismo dei mi mentre DCL4 porta ad una segnalazione pre-stabilita dov'è coinvolta nei ta. Si ipotizza che i ta-siRNA si sarebbero evoluti per permettere il trasferimento dell'azione dei miRNA a cellule vicine, ovviando all'impossibilità di miRNA di agire fuori dalla cellula di origine. Dati che confermerebbero questa interpretazione derivano dallo studio dello sviluppo fogliare in particolare sullo sviluppo della polarità della foglia, questo studio è stato fatto sul locus TAS 3 di Arabidopsis a livello della foglia, TAS 3 può generare attraverso l'intervento di un miRNA un ta-siRNA che viene accumulato a livello di primordio fogliare secondo un gradiente, quindi attribuendo polarità alla foglia.
5. nat-siRNA (natural antisense transcript siRNA): si parte da un gene detto NAT, tali geni sono presenti su due filamenti opposti e sono orientati in modo opposto perché uno serve al filamento 5-3 l'altro al 3-5. C'è una zona dove il trascritto di questi due geni è complementare, la componente complementare può essere vista come un dsRNA e quindi va incontro al processamento come avviene di solito, quindi interazione con DCL che sono la 1 e la 2, HEN1 e AGO. Non c'è un bersaglio perché non c'è degradazione o inibizione della trascrizione, i bersagli dei nat-siRNA sono i geni stessi da cui derivano. I geni con l'organizzazione descritta (antiparallela) non sono particolarmente rari per cui è probabile che questo genere di meccanismo sia evoluto come una regolazione fine dell'espressione genica.
